FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PAMPA

Tesina presentada para obtener el grado académico de LICENCIATURA EN QUÍMICA

Uso de bioensayos para la evaluación toxicológica de efluentes provenientes de la producción láctea en la provincia de La Pampa

Autora: CAMILA RODRIGUEZ

SANTA ROSA (LA PAMPA), ARGENTINA

2016

Rodriguez, Camila Uso de bioensayos para la evaluación toxicológica de efluentes provenientes de la producción láctea en la provincia de La Pampa / Camila Rodriguez. - 1a ed. - Santa Rosa : Universidad Nacional de La Pampa, 2018. Libro digital, EPUB - (Publicación de tesis de grado, maestría, doctorado y trabajos finales de especialización ; 2) Archivo Digital: descarga y online ISBN 978-950-863-342-2 1. Ciencias Químicas. 2. Educación Superior. I. Título.

CDD 540.711

PREFACIO

Esta Tesina es presentada como parte de los requisitos para optar al grado Académico de Licenciado en Química de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de La Pampa y no ha sido presentada previamente para la obtención de otro título en esta Universidad ni en otra Institución Académica. Se llevó a cabo en Santa Rosa, La Pampa, durante el periodo comprendido entre el 08 de abril de 2016 y el 21 de junio de 2017, bajo la dirección de la Dra. Silvia Laura Fanelli y la codirección de la Ing. Ingrid Violeta Poggio Herrero.

Camila Rodriguez
Departamento de Química
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad Nacional de la Pampa

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero agradecerles a mi directora y codirectora, Silvia Fanelli y Violeta Poggio, porque me brindaron sus conocimientos, tiempo y buena predisposición, para que pueda realizar este trabajo y obtener el título de Licenciada en Química. Gracias en general al grupo de Toxicología, porque siempre me sentí a gusto trabajando con ustedes.

A la Universidad Nacional de La Pampa, Institución que me forjó y formó durante estos años, donde crecí personal y académicamente.

A Alberto, Laura y Vanina, por recibirme en su lugar y hacerme sentir a gusto.

A Graciela Bazán y su equipo, por prestarnos la cámara de cultivo.

Al dueño y personal de la industria láctea que, gracias a su buena predisposición, pude realizar este trabajo.

A mis amigas de la vida y a quienes tuve el placer de conocer durante este camino, porque me ayudaron a atravesarlo de forma amena.

A Tato, mi compañero de vida.

Y, por último, a mi familia, mi sostén. A mis padres por hacer todo para que tenga el privilegio de formarme profesionalmente. Y a mi hermano, que es mi vida entera.

RESUMEN

La diversidad de procesos de la industria alimentaria la hace uno de los sectores productivos con mayor impacto ambiental. La industria láctea, en particular, genera grandes volúmenes de residuos líquidos, en los que podemos encontrar leche diluida, suero, grasas, aceites, sólidos, nutrientes, subproductos de la elaboración del queso, y derivados del proceso de limpieza. La descarga de estos residuos sin tratamiento previo a un cuerpo de agua o al suelo, generará un gran impacto ambiental.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la toxicidad de efluentes generados en un establecimiento quesero de la provincia de La Pampa, por medio de bioensayos de toxicidad aguda con Daphnia magna, estimando la efectividad del tratamiento previo a la disposición final del efluente.

Los neonatos de D. magna se expusieron a diferentes concentraciones del efluente de entrada (E) y salida (S) de la planta de tratamiento evaluando inmovilidad y determinando la CE₅₀ para cada punto de muestreo. El análisis de DQO, pH, conductividad, sólidos totales, sólidos totales en suspensión y sólidos sedimentables fueron complementarios.

Los parámetros fisicoquímicos del efluente pre y post tratamiento no resultaron significativamente diferentes, aunque los valores de pH, sólidos y DQO no cumplían con lo permitido por la legislación provincial. Las CE₅₀ de E fueron menores al 1%, indicando elevada toxicidad. Aunque las CE₅₀ para las muestras de S fueron más elevadas (2,56-2,66 %), la toxicidad sigue siendo alta. El efluente vertido se encuentra fuera de los límites permitidos por la reglamentación y el tratamiento aplicado resulta ineficaz para disminuir la toxicidad. Se sugiere revisar el método de tratamiento, así como la capacidad de esta planta alimenticia en relación a la cantidad de residuo líquido que emite.

Palabras clave: Bioensayos, Daphnia, efluentes, toxicidad, industria láctea

ABSTRACT

The diversity of processes in the food industry makes it one of the productive sectors with the greatest environmental impact. The dairy industry, in particular, generates large volumes of liquid waste, where they can find diluted milk, whey, fats, oils, solids, nutrients, cheese processing byproducts and derivatives of the cleaning process. The discharge of this waste without pretreatment to a body of water or to the soil, generate a great environmental impact.

The objective of this work was to evaluate the toxicity of effluents generated in a cheese factory in the province of La Pampa by means of acute toxicity bioassays with Daphnia magna, estimating the effectiveness of the previous treatment to the final disposal of the effluent.

The neonates of D. magna were exposed to different concentrations of the incoming (E) and outlet (S) effluent from the treatment plant, evaluating immobility and determining the EC₅₀ for each sampling point. The analysis of COD, pH, conductivity, total solids, total suspended solids and sediment solids were complementary.

The physicochemical parameters of the effluent, pre and post treatment were not significantly different, although the values of pH, solids and COD did not comply with what was allowed by provincial legislation. EC₅₀ of E was less than 1%, indicating high toxicity. Although the EC₅₀ for S samples were higher (2.56-2.66%), the toxicity remains high. The effluent discharged is outside the limits allowed by the regulations and the applied treatment is ineffective to decrease the toxicity. It is suggested to review the treatment method as well as the capacity of this food plant in relation to the amount of liquid residue it emits.

Keywords: Bioassays, Daphnia, effluent, toxicity, dairy industry

1. Introducción

1.1. Industrias lácteas

La industria alimentaria es uno de los sectores productivos que mayor impacto tiene sobre el medio ambiente, debido a la diversidad de sus procesos y/o productos que salen al mercado. Cada sector, según su actividad, genera residuos en porcentajes diferentes de acuerdo con los tipos de productos elaborados. La industria láctea genera una gran cantidad de residuos sólidos y líquidos, incrementados al mejorar la productividad, calidad y sanidad de los mismos (González Cáceres; 2012).

INDUSTRIA QUESERA – EFLUENTES

El queso es un producto fundamental de la industria láctea. Se estima que, de un total de 9895 millones de litros de leche obtenidos en el año 2016, 3680 se utilizaron para la fabricación de distintos productos lácteos (leche y productos lácteos concentrados, en polvo, fermentado, crema, manteca, postres, helados, quesos, dulce de leche). Aproximadamente 2101 millones de litros, se utilizaron para la fabricación de quesos (Ministerio de Agroindustria; 2016).

La industria lechera genera aproximadamente 0,2 a 10 litros de efluente por litro de leche procesada (promedio 2,5 litros de aguas residuales/litro de leche procesada). La fabricación de quesos, leche en polvo y plantas de evaporación, generan un mayor volumen de residuos que las productoras de leche pasteurizada (Olorunfemi et al.; 2012). La parte más importante de volumen de agua residual, proviene de la limpieza de equipos y superficies (Instituto Tecnológico Agroalimentario) y, dentro de estos residuos líquidos, se puede encontrar leche diluida, suero, grasas, aceites, sólidos suspendidos y nitrógeno (Valencia and Ramírez; 2009).

El principal subproducto de la industria láctea es el suero, que retiene cerca del 55% de los componentes de la leche. Se presenta como un líquido amarillo-verdoso que se obtiene tras la separación de la cuajada. Su composición es afectada por el tipo de coagulación empleada en la elaboración del queso. Se estima que por cada kg de queso se producen 9 kg de lacto suero (González Cáceres; 2012).

Los principales efectos medio ambientales generados durante el proceso de elaboración de queso aumentan con las operaciones auxiliares utilizadas para garantizar la calidad del producto elaborado, como son la limpieza y desinfección de equipos e instalaciones. Estas tareas se llevan a cabo empleando detergentes y desinfectantes, y una gran cantidad de agua, lo cual aumenta los volúmenes de efluentes y su carga orgánica (González Cáceres; 2012).

Estos grandes volúmenes de residuos tienen como destino final cuerpos de agua o campos de drenaje (González Cáceres; 2012). Al aportar nutrientes como P y N y presentar variaciones significativas en el pH y la temperatura durante el día, la descarga de estos líquidos, sin previo tratamiento, a un cuerpo de agua (o al suelo formando lagunas), generará un gran impacto ambiental, dependiendo de la carga contaminante y el volumen de vertido (Metropolitana; 1998).

Minimizar la generación de corrientes contaminantes no apunta solo al cumplimiento de la normativa ambiental vigente, sino también a aumentar la rentabilidad de la empresa ya sea en términos de recuperación de productos comercializables, como en términos de reducción de los costos de tratamientos de los efluentes (Metropolitana; 1998).

PROCESO DE ELABORACIÓN DEL QUESO

El proceso de fabricación del queso, con variantes específicas para cada tipo de queso, consta de las siguientes etapas (Figura 1) (INTA EEA Chubut, Poncelet, Industrial, 2008, González Cáceres; 2012).

Recepción y tratamientos previos de la leche, entre los que se incluyen refrigeración, higienización, pasteurización, etc.

Coagulación, corte y separación parcial del suero

Llenado de moldes y prensado previo

Salado

Secado

Maduración

Figura 1. Proceso general de elaboración del queso

DESCRIPCIÓN DE LAS OPERACIONES DEL PROCESO PRODUCTIVO, OPERACIONES AUXILIARES – consideraciones medioambientales

Coagulación

La operación de coagulación se basa en provocar la alteración de la caseína y su precipitación, dando lugar a una masa gelatinosa que engloba todos los componentes de la leche. Se realiza en cubas que no deben moverse ni golpearse, ya que, de no ser así, se puede alterar el proceso con la consecuente pérdida de caseína con el residuo líquido. Se puede llevar a cabo de tres formas: coagulación ácida, coagulación enzimática o coagulación mixta. Durante esta etapa pueden producirse pérdidas o derrames de leche durante su manipulación (INTA EEA Chubut, Poncelet, CAR/PL-UNEP; 2002).

Corte y desuerado

El gel formado en la coagulación, cualquiera que sea el método empleado, constituye un estado físico inestable. Según las condiciones en las que se encuentra la fase líquida o lactosuero que lo impregna, se separa más o menos rápidamente. Este fenómeno es el que se conoce como desuerado.

Según el tipo de coagulación se obtiene un tipo de lactosuero distinto:

Suero dulce: generado durante la coagulación enzimática de la leche. Generalmente contiene entre 0,6 – 0,9 % de proteína soluble, alrededor de 0,3 % de grasa y una gran cantidad de lactosa (más de 5 %). En este tipo de suero, la presencia de ácido láctico es prácticamente inapreciable.

Suero ácido: se genera cuando se realiza coagulación ácida. Este tipo de lacto suero contiene aproximadamente la misma proporción de proteína soluble que el lactosuero dulce, pero una menor proporción de grasa y lactosa (4,5 %), y el ácido láctico representa hasta un 0,8 %.

El principal aspecto medioambiental generado durante la elaboración de quesos, es la producción de lactosuero. Su contenido de lactosa y proteínas aumenta el grado de contaminación de las aguas residuales. Por esta razón es importante minimizar el vertido de lactosuero junto con el resto de las aguas residuales (INTA EEA Chubut, Poncelet, CAR/PL-UNEP; 2002).

Moldeo y prensado

El moldeo consiste en verter los trozos de cuajada en moldes. Estos moldes suelen ser de plástico, pero también pueden ser de metal o madera, y deben ser de tales características que le confieran al queso acabado las medidas y el peso establecido. El prensado se aplica para favorecer la expulsión del suero intergranular de la cuajada y dar al queso su forma definitiva. Durante el prensado también se produce la salida de lactosuero de la masa del queso, aunque la cantidad generada en esta etapa es menor que en el desuerado (INTA EEA Chubut, Poncelet, CAR/PL-UNEP; 2002).

Salado

El salado es uno de los factores que más influyen en darle el sabor deseado al queso. Además, interviene en la regulación del contenido de suero y de la acidez. La sal hace que se esponje la pasta del queso, asegura su conservación (junto con el valor de pH), inhibe la germinación de los microorganismos causantes del hinchamiento, y estimula el desarrollo de la flora de maduración del queso. El contenido de sal también influye en la consistencia del queso: cuanto mayor es el contenido de sal, mayor es la consistencia del queso.

El salado se puede realizar sobre la leche (en la cuba) o sobre el queso, empleando salmueras (al 16 – 22 % de sal) o sal seca. El tiempo y la cantidad de sal necesarios dependerán del tipo de queso y del método de salado.

En la etapa de salado se produce el consumo de agua para la formación de la salmuera y el vertido puntual de éstas una vez que se agotan. En caso de realizarse el salado mediante la aplicación de sal seca sobre la superficie del queso, se producen restos de sal que se retiran con las aguas de limpieza. Esto produce un vertido de elevada conductividad (INTA EEA Chubut, Poncelet, CAR/PL-UNEP; 2002).

Secado

Una vez terminada la operación de salado, el queso puede exponerse a una corriente de aire para que se seque la superficie. El secado superficial es especialmente importante cuando el queso se envuelve o se recubre de cera para su maduración (CAR/PL-UNEP; 2002).

Maduración

Los quesos son llevados a las salas o cámaras de maduración, en las que se controla la temperatura y la humedad. La maduración del queso incluye procesos físicos, microbiológicos y enzimáticos, dando lugar a un producto acabado con determinadas características de aroma, sabor y textura (INTA EEA Chubut, Poncelet, CAR/PL-UNEP; 2002).

Figura 2. Aspectos medioambientales del proceso de elaboración del queso. Tomado de CAR/PL-UNEP (2002), González Cáceres (2012).

OPERACIONES AUXILIARES EN LA INDUSTRIA LÁCTEA: limpieza y desinfección

Debido a las características de la materia prima empleada y a los productos fabricados, las condiciones higiénicas de los equipos e instalaciones de las empresas lácteas deben garantizar la calidad de los productos elaborados. Así, el mantenimiento de las condiciones higiénicas exige llevar a cabo operaciones de limpieza y desinfección en forma continua. Estas operaciones suponen la mayor parte del consumo de agua, energía y productos químicos, generando como consecuencia un considerable volumen de aguas residuales (CAR/PL-UNEP; 2002, González Cáceres; 2012).

Los productos químicos utilizados durante la limpieza generalmente se aplican en forma de disoluciones acuosas de carácter ácido o básico. Los detergentes alcalinos provocan la emulsión de las grasas, lo que permite que puedan ser arrastradas fácilmente; mientras que los productos ácidos disuelven y eliminan las incrustaciones formadas por acumulación de las sales de la leche y del agua (CAR/PL-UNEP; 2002, Valencia and Ramírez; 2009).

Los desinfectantes contienen como compuesto germicida sustancias alcalinas, cloro y oxígeno. Además contienen otras sustancias como ácidos y bases, inhibidores de corrosión y formadores de complejos para mejorar su aplicación industrial (CAR/PL-UNEP; 2002).

Como consecuencia de las operaciones de limpieza se produce el vertido de las aguas residuales, junto con los productos químicos utilizados y la carga orgánica debida al arrastre o disolución de los restos de producción. Estas aguas residuales alcanzan valores de DQO muy elevados debido, principalmente, al aporte de la leche y de forma minoritaria por los detergentes utilizados durante la limpieza (CAR/PL-UNEP; 2002).

Otro aspecto importante en la utilización de productos detergentes es el contenido en fosfatos y/o nitratos, ya que contribuyen de forma importante en los procesos de eutrofización de las aguas (CAR/PL-UNEP; 2002).

1.1.2. Industria objeto de estudio

La localidad de General Campos (Departamento Guatraché) a 142 km al sur de Santa Rosa, tiene la mayor cuenca lechera de la provincia con un total de 7 fábricas activas (alimentos balanceados, chacinados, dulce de leche y crema, panificadora y quesos blandos, duros y semiduros) (Gobierno de La Pampa).

La industria láctea objeto de estudio, se dedica a la fabricación de quesos y dulce de leche. A su vez el suero generado como residuo, es procesado en otro establecimiento. El resto del efluente de la quesería, y los efluentes del procesamiento del suero, se procesan en una planta de depuración, donde primero se separa la grasa y luego se realiza un tratamiento con bacterias. Como destino final el agua tratada se utiliza para el riego del predio de la empresa (Figura 3)

Figura 3. Diagrama del sistema de tratamiento de efluentes

1.2. Marco legal: nacional y provincial

A nivel nacional, está vigente la Ley 25.612 de Gestión Integral de Residuos Industriales y de Actividades de Servicios, cuyos objetivos, detallados en el Art. 4 del capítulo I, son:

Garantizar la preservación ambiental, la protección de los recursos naturales, la calidad de vida de la población, la conservación de la biodiversidad, y el equilibrio de los ecosistemas;

Minimizar los riesgos potenciales de los residuos en todas las etapas de la gestión integral;

Reducir la cantidad de los residuos que se generan;

Promover la utilización y transferencia de tecnologías limpias y adecuadas para la preservación ambiental y el desarrollo sustentable;

Promover la cesación de los vertidos riesgosos para el ambiente.

Según el Art. 29, Capítulo VIII, se denomina planta de tratamiento a aquellos sitios en los que se modifican las características físicas, la composición química o la actividad biológica de cualquier tipo de residuo industrial y de actividad de servicio, de modo tal que se eliminen o reduzcan sus propiedades nocivas, peligrosas o tóxicas, o se recupere energía y recursos materiales, o se obtenga un residuo de niveles de riesgo menor, o se lo haga susceptible de recuperación o valorización, o más seguro para su transporte o disposición final, bajo normas de higiene y seguridad ambientales que no pongan en riesgo ni afecten la calidad de vida de la población, en forma significativa (Información Legislativa y Documental).

En la Provincia de La Pampa se encuentra vigente la Ley 1.914. Ley Ambiental Provincial (2000). Esta Ley está parcialmente reglamentada por el Decreto N° 2793/06, en el cual se detallan los valores máximos de emisión para: a) desagüe a conducto pluvial abierto, curso de agua superficial elemental cerrada y cursos de agua no permanente, y b) desagüe a pozos o a campos de drenaje (Subsecretaría de Ecología, 2006) (Tablas 1 y 2).

Tablas 1 y 2: Límites máximos de parámetros físicos y químicos para descarga de los efluentes líquidos. Decreto Nº 2793/06

1. Desagües a conducto pluvial abierto, curso de agua superficial elemental cerrada y cursos de agua no permanente.

2. Desagües a pozos o a campos de drenaje.

1.3. Toxicología

La toxicología se define como la ciencia que estudia las sustancias químicas y los agentes físicos en cuanto son capaces de producir alteraciones patológicas a los seres vivos, a la par que estudia los mecanismos de producción de tales alteraciones y los medios para contrarrestarlas, así como los procedimientos para detectar, identificar y determinar tales agentes y valorar su grado de toxicidad (Repetto; 1997).

Esta ciencia ha evolucionado desde la antigüedad debido a la contribución de diferentes ramas de la biología, química, matemática y física. Actualmente, abarca no solo el estudio de los efectos adversos de los agentes exógenos, sino también el estudio de la biología molecular, usando las sustancias tóxicas como herramienta. Esta disciplina se aplica a la evaluación de la seguridad y la evaluación de riesgos (Faustman et al.; 2008).

La evaluación del riesgo es la estimación cuantitativa de los efectos potenciales sobre la salud humana y la importancia ambiental de los diversos tipos de exposiciones químicas. La variedad de efectos adversos potenciales y la diversidad de sustancias químicas en el medio ambiente hacen a la toxicología una ciencia amplia, que a menudo exige la especialización en un área en particular de la toxicología (Faustman et al.; 2008).

1.4. Ecotoxicología

La ecotoxicología es la rama de la toxicología que estudia a los contaminantes en la biósfera y sus efectos sobre los constituyentes de la misma. Tiene el objetivo fundamental de explicar y predecir los efectos o fenómenos de exposición a diferentes niveles de la organización biológica (Faustman et al.; 2008)

La forma del contaminante, las posibles asociaciones, y el movimiento dentro de la biósfera son temas centrales en la ecotoxicología, porque determinan la exposición, biodisponibilidad y la dosis real (Faustman et al.; 2008)

1.4.1. Ensayos de toxicidad

Muchos enfoques han sido desarrollados para detectar y cuantificar los efectos contaminantes. Los enfoques comúnmente utilizados en la ecotoxicología incluyen pruebas de toxicidad estandarizadas diseñadas para satisfacer las necesidades de regulación y biomarcadores de exposición de los organismos y los efectos (Castillo Morales et al.; 2004, Faustman et al.; 2008).

Si bien es ampliamente conocido que los ensayos de toxicidad no pueden imitar las complejas interacciones y las condiciones variables de los ecosistemas naturales, éstos abordan los efectos directos potenciales de las sustancias tóxicas en los componentes de los ecosistemas individuales de forma controlada y reproducible (Faustman et al.; 2008).

Los ensayos toxicológicos se realizan sobre una amplia variedad de especies acuáticas (incluyendo algas, invertebrados, renacuajos, bivalvos, camarones, pescados), aves (codorniz, pato), y especies terrestres (microorganismos del suelo, cultivos, abejas, lombrices, mamíferos salvajes). Las especies son seleccionadas por su uso frecuente como animal de laboratorio, pero también de acuerdo a la relevancia ecológica, lo que hace más compleja la armonización global del ensayo (Castillo Morales et al.; 2004, Faustman et al.; 2008).

El ensayo de toxicidad aguda consiste en la exposición de una especie a varias concentraciones de la sustancia objeto de prueba. El punto final más común en los ensayos agudos es la muerte, y ocasionalmente se aplican puntos finales no letales para lo que se tiene en cuenta el comportamiento anormal o cambios fisiológicos (ej.: inmovilización de Daphnia sp.) (Faustman et al.; 2008).

Las curvas de dosis respuesta obtenidas a partir de diferentes ensayos son utilizadas para predecir valores como LC₅₀, EC₅₀, o IC₅₀. La LC₅₀ representa la concentración de la sustancia de ensayo que mata el 50% de la población expuesta, y EC₅₀ es la concentración de la sustancia de ensayo que afecta al 50% de la población de prueba durante un período específico de tiempo, como el crecimiento; la IC₅₀ es la concentración que causa una reducción del 50% en una medición no cuantal (tal como el movimiento) para la población de prueba (Faustman et al.; 2008).

1.4.2. Organismos de prueba

Dentro del grupo de los cladóceros, las especies del género Daphnia (Figura 4) están entre los organismos de prueba o referencia en pruebas de toxicidad más utilizados mundialmente. La amplia distribución geográfica, el importante papel que cumplen en el interior de la comunidad zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproducción partenogénica (que asegura una uniformidad de respuesta), y el corto ciclo de vida con la producción de un alto número de crías, hacen que este grupo sea ideal como modelo biológico para la evaluación de toxicidad (Castillo Morales et al.; 2004).

El género Daphnia se ubica dentro del orden cladócero, clase Crustácea y especies como D. magna, D. pulex y D. similis, son utilizadas extensivamente en pruebas de toxicidad, existiendo una gran cantidad de información sobre las técnicas de cultivo, los requisitos de temperatura, luz y nutrientes, así como su respuesta a muchos compuestos tóxicos. Específicamente, los ensayos de toxicidad con D. magna, permiten determinar la letalidad potencial de sustancias puras, aguas residuales domésticas e industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterráneas, agua potable, entre otros (Castillo Morales et al.; 2004).

Figura 4. Vista general de Daphnia magna, tomado de Castillo Morales et al.; 2004.

2. Hipótesis y objetivos

La industria láctea genera una variedad de residuos, por lo cual la descarga de efluentes sin tratamiento previo a un cuerpo de agua o al suelo, generará un gran impacto ambiental. La evaluación de la toxicidad de dichos efluentes permitiría estimar la efectividad del tratamiento previo a la disposición final del mismo.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la toxicidad de efluentes generados en un establecimiento quesero de la provincia de La Pampa, por medio de bioensayos de toxicidad aguda con Daphnia magna, estimando la efectividad del tratamiento previo a la disposición final del efluente.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar los efectos letales sobre la población bajo estudio (Daphnia magna).

Evaluar la efectividad del tratamiento previo al vertido o disposición final del efluente.

Generar una herramienta para establecer bio-indicadores de contaminación en establecimientos lecheros y/o fábricas de derivados lácteos.

3. Materiales y métodos

3.1. Materiales y reactivos utilizados

3.1.1. Reactivos

Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron de calidad p.a.

Ácido sulfúrico diluido Carlo Erba

Agua destilada

Bicarbonato de sodio Anedra

Cloruro de potasio Anedra

Dicromato de potasio Merck

Oxalato de sodio Cicarelli

Permanganato potásico Cicarelli

Sulfato de calcio Anedra

Sulfato de magnesio anhidro Cicarelli

3.1.2. Material de laboratorio

Aireador

Bureta

Cono de Imhoff

Equipo de filtrado

Filtros estándar de fibra de vidrio (tamaño de malla de 1 µm)

Gradillas

Matraces 25 – 1000 ml

Micropipetas

Parafilm

Peceras

Pipetas 5 – 10 mL

Pipetas Pasteur

Tubos de ensayo

Vasos de precipitado

3.1.3. Equipos de laboratorio

Balanza analítica Ohaus.

Conductímetro mSiemen (Trans Instruments).

pHmetro Cole Parmer ®.

3.2. Muestreo

Las muestras se tomaron en dos puntos, a la entrada y a la salida de la planta de tratamiento.

Se hicieron tres muestreos por triplicado, en abril, junio y agosto del año 2016. Se recolectaron tres litros de efluente por punto de muestreo en botellas de plástico, y fueron conservadas a 4ºC sin adición de ningún conservante.

3.3. Material biológico

3.3.1. Cultivo de Daphnia magna

Las hembras adultas se mantuvieron en recipientes de vidrio de 3L de capacidad con medio nutritivo (agua dura reconstituida) (Figura 5). El medio se preparó según la siguiente formulación: 0,124 g MgSO₄; 0,0082 g KCl; 0,198 g NaCO₃H; 0,048 g CaSO₄; se completó a volumen (1 L) con agua destilada, y se estableció el pH en 7,6 ± 0,4 (Castillo Morales et al.; 2004).

Figura 5. Cultivo de Daphnia magna en sus diferentes estadios.

Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 22 ± 2 °C, con un fotoperiodo de 16 horas luz:8 horas oscuridad (Castillo Morales et al.; 2004) (Tabla 3).

Tabla 3: Condiciones para el mantenimiento de los cultivos de Daphnia magna, tomado de(Castillo Morales et al.; 2004).

Dependiendo del desarrollo del cultivo, los neonatos se retiraron cada 1 a 3 días aproximadamente, y eran destinados al desarrollo de pruebas o eliminados. Con igual frecuencia, se efectuó la limpieza y el suministro de alimento, removiendo las mudas y los restos de alimento del fondo. Finalizada la limpieza, se realizó un recambio de medio de 1/3 del volumen con medio nutritivo fresco.

Cada cuatro o cinco semanas, se inició un nuevo cultivo con neonatos recién recolectados, desechando los organismos más viejos (Castillo Morales et al.; 2004) (Figura 6).

Figura 6. Cultivo de Daphnia magna y su ciclo de renovación, tomado de Castillo Morales et al.; 2004.

El día previo a realizar un bioensayo, se separaron los neonatos del cultivo, para asegurar que tengan menos de 24 horas de nacidos al inicio del bioensayo.

Para la alimentación de los cultivos de D. magna se utilizó una suspensión de algas de Scenedesmus sp. La alimentación se llevó a cabo 3-4 veces por semana, luego de la limpieza.

Para el control de calidad de los cultivos de D. magna, fue necesario establecer la sensibilidad de los organismos de prueba a través de la carta de control con el compuesto de referencia, K₂Cr₂O₇. Para establecer los cambios en la sensibilidad del cultivo se realiza mensualmente un ensayo con el compuesto de referencia (Castillo Morales et al.; 2004).

3.4. Bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna

Para las pruebas de toxicidad aguda con D. magna, neonatos <24 horas de nacidos fueron expuestos a diferentes diluciones de las muestras durante un período de 48 horas. Al finalizar la prueba, se cuantificó la cantidad de organismos muertos (inmóviles). A partir de estos resultados se estableció el porcentaje de mortalidad correspondiente a cada concentración para luego estimar la CE₅₀ a las 48 horas (Castillo Morales et al.; 2004) (Figura 7).

Figura 7. Diagrama de flujo de las actividades vinculadas al desarrollo del ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna, tomado de (Castillo Morales et al.; 2004).

3.5. Metodología Probit para el cálculo de CE₅₀

Para el cálculo de la CE50 y sus respectivos límites de confianza al 95% se utilizó el método Probit. Este método permite estimar la CE₅₀, ajustando los datos para estimar valores que siguen una distribución logarítmica. El porcentaje de respuesta sobre Daphnias por la acción tóxica de una sustancia se transforma a unidades Probit. Esta transformación permite el ajuste a una línea de regresión, en la cual la concentración perteneciente al Probit 5, corresponderá a la cantidad de sustancia capaz de generar el efecto estudiado en la mitad de la población (Gráfico 1) (USEPA; 1999, Díaz Báez et al.; 2004).

Una de las restricciones del método es que para el cálculo de la CE₅₀ deben obtenerse valores intermedios entre 0 y 100% de mortalidad.

La aceptabilidad de los resultados depende de dos factores:

La mortalidad en el control negativo no debe exceder el 10%.

La CE₅₀ para el tóxico de referencia deberá estar dentro de los límites de confianza preestablecidos en la carta control (Castillo Morales et al.; 2004).

Grafico 1: Trasformación del % de respuesta a unidades Probit

3.6. Determinación de la demanda química de oxígeno - índice de oxidabilidad

Se llama Índice de Oxidabilidad, al oxígeno del permanganato de potasio que consume una muestra de agua cuando se la trata con este reactivo en determinadas condiciones (concentración de los reactivos, temperatura, tiempo de calentamiento).

El consumo de oxígeno proporciona un índice del grado de contaminación, concentración o carga de la muestra, siendo de utilidad cuando no se realizan determinaciones de DBO (demanda bioquímica de oxígeno), o como dato complementario, considerándose como una forma de determinación de la DQO (demanda química de oxígeno).

La técnica consiste en medir, en medio ácido, la cantidad de oxígeno utilizado para la reducción del permanganato potásico por la materia orgánica de origen animal o vegetal contenida en la muestra de agua.

La determinación se realiza mediante una volumetría por retorno, utilizando KMnO₄ y Na₂C₂O₄ como reactivos en medio H₂SO₄, obteniendo una coloración rosada persistente en el punto final (actuando el permanganato de potasio como autoindicador).

Procedimiento

La determinación de DQO se realizó siguiendo las recomendaciones de Standard Methods 1992 (APHA; 1992).Se prepararon diluciones de cada una de las muestras (en matraces de 100 ml) y se trasvasaron a erlenmeyers de 250 ml; a cada muestra se le agregaron 5 ml de H₂SO₄ diluido (1:3) y 20 ml de KMnO₄ (0,0125 N). Se llevaron a baño María durante 30 minutos y se añadieron 20 ml de oxalato de sodio (0,0125 N), produciéndose la decoloración completa. Se valoró el oxalato de sodio en exceso con KMnO₄ (0,0125 N) hasta viraje a rosado débil (APHA; 1992).

Cálculo y expresión de los resultados

mg de oxígeno

=

[{(V¹ * N¹) + (V² * N²)} - (V³ * N³)] * Peq (mg) * 1000

l

Vm(meq)

Los resultados se expresan en mg/l de oxígeno consumido:

Donde:

V₁ = volumen del permanganato de potasio adicionado a la muestra

V₂ = volumen del permanganato de potasio gastado en la titulación

V₃ = volumen de oxalato de sodio adicionado a la muestra

N₁ = normalidad del permanganato de potasio

N₂ = normalidad del permanganato de potasio

N₃ = normalidad del oxalato de sodio

Peq = peso equivalente del oxígeno

VM = volumen de muestra

3.7. Determinación de sólidos

Se denomina “sólidos” a los materiales suspendidos o disueltos en aguas limpias o aguas residuales que pueden afectar negativamente a la calidad del agua.

Los análisis de sólidos son importantes en el control de procesos de tratamiento biológico y físico de aguas residuales, y para evaluar el cumplimiento de las limitaciones que regulan su vertido (APHA; 1992).

3.7.1. Sólidos totales secados a 103 - 105 ºC

Son los residuos resultantes luego de la evaporación y secado de la muestra en una estufa a 103 – 105ºC (Laboratorio Dinama; 1996).

Procedimiento

Se calentó una placa de evaporación, previamente pesada y limpia, a 103 – 105 ºC; y se conservó en desecador hasta el momento de uso.

Se midió un volumen de muestra (100ml) y se lo colocó en la placa previamente pesada y se dejó evaporar hasta peso constante en una estufa a 103 – 105 ºC.

Se guardó la placa en un desecador para enfriar y luego se pesó (APHA; 1992).

Cálculo y expresión de los resultados

mg de sólidos totales

=

(A-B) * 1000

l

volumen de muestra, ml

Donde:

A = peso del residuo seco + placa, mg, y

B = peso de la placa, mg.

3.7.2. Sólidos totales en suspensión secados a 103 - 105 ºC

Son los materiales retenidos por un filtro estándar de fibra de vidrio, con un tamaño de malla de 1 µm, secado a 103 – 105 ºC (Laboratorio Dinama; 1996).

Procedimiento

Se secaron los filtros de lana de vidrio en un horno a 103 – 105 ºC durante una hora, se dejaron enfriar en desecador para equilibrar la temperatura, y se pesaron al momento de ser utilizados.

Se filtró un volumen de muestra medido (100ml). Luego de filtrado se colocaron los filtros en una placa y se los dejó secando durante 24 horas en horno a 103 – 105 ºC. Se dejaron enfriar en un desecador y se pesaron (APHA; 1992).

Cálculo y expresión de los resultados

mg de sólidos totales en suspensión

=

(A-B)*1000

l

volumen de muestra, ml

Donde:

A = peso del filtro + residuo seco, mg

B = peso del filtro, mg.

3.7.3. Sólidos sedimentables

Se denomina sólidos sedimentables al material que se desprende de la suspensión en un período determinado (APHA; 1992).

Procedimiento

Se llenó un cono de Imhoff hasta la marca con un volumen de muestra previamente mezclado y se dejó sedimentar. Se realizaron lecturas del volumen de sedimento a los 10, 30, 60 y 120 minutos (APHA; 1992).

Expresión de los resultados

Los resultados se expresan en ml de sólidos sedimentables/l de muestra a los 10, 30, 60, 120 minutos (Laboratorio Dinama; 1996).

3.8. Determinación de pH

Se determinó el pH en cada una de las muestras de efluentes, utilizando un pHmetro Cole Parmer®.

3.9. Determinación de conductividad

Se determinó la conductividad en cada una de las muestras de efluentes, utilizando un Conductímetro mSiemen (Trans Instruments).

3.10. Análisis estadístico de los datos

El análisis estadístico de los datos, se realizó con el programa Infostat versión 2016 (Di Rienzo et al. 2016). Luego de aplicar el test de normalidad de Shapiro-Wilks modificado, se realizaron comparaciones entre los muestreos, a la entrada y a la salida de la planta de tratamiento, utilizando ANOVA - Test de Tukey (para población normal) o Prueba de Kruskal Wallis (para población que no sigue la normalidad). A su vez se realizaron estudios de correlación entre los distintos parámetros determinados, utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (población normal) o de Spearman (población no normal) según corresponda (Di Rienzo et al. 2016).

4. Resultados y discusión

En la siguiente tabla se expresan los resultados obtenidos para cada muestra de entrada y salida a la planta de tratamiento (Tabla 4).

Tabla 4: Parámetros físico químicos de cada muestra de entrada y salida a la planta de tratamiento de efluentes

Muestra

Parámetros

pH

Cond.

SS

ST

SF

DQO

M1 - E

4,34 + 0,06

7,5 + 0,01

2

0,9351

0,0561

4295

10

12

13

M1 - S

4,16 + 0,02

7,4 + 0,02

2

0,9791

0,0714

4441

12

13

14

M2 - E

4,31 + 0,02

7,1 + 0,01

1

0,8247

0,0806

2840

4

12

14

M2 - S

4,20 + 0,01

8,4 + 0,01

8

0,7968

0,1036

2431

16

18

20

M3 - E

4,42 + 0,03

8,5 + 0,02

2

0,8457

0,0540

3016

4

8

12

M3 - S

4,59 + 0,02

8,2 + 0,01

2

0,6528

0,0930

2460

6

15

15

Tabla 4: se presentan los resultados de las seis muestras tomadas en la planta de tratamiento a la entrada y a la salida. Las siglas M 1, 2 y 3 representan las tres fechas de muestreo; E y S, hacen referencia a si la muestra se tomó a la entrada o salida de la planta de tratamiento. Los parámetros físico – químicos que se midieron son: pH y conductividad (mS) con sus respectivas desviaciones estándar; Sólidos Sedimentables (SS) (ml de sedimentos/l de muestra) medidos a los 10, 30, 60 y 120 minutos; Sólidos Totales (ST) (g de sólidos/100 ml de muestra); Sólidos Filtrables (SF) (g de sólidos/100 ml de muestra) y DQO (mg de O₂/l).

El análisis de ANOVA aplicado a los parámetros físico químicos no indicó diferencias significativas entre los parámetros determinados a la entrada ya la salida de la planta de tratamiento (Tabla 4).

Los valores de pH obtenidos a la entrada y a la salida de la planta de tratamiento rondan un promedio de 4,34 ± 0,16 (Tabla 4), encontrándose por fuera de los límites para el vertido establecidos en el Decreto Nº 2793/06 de la Provincia de La Pampa (Subsecretaría de Ecología; 2006). En las aguas residuales de las industrias queseras es común la presencia de restos de leche, proveniente de derrames que se producen durante el proceso de producción, limpieza de equipos y superficies (Instituto Tecnológico Agroalimentario). La descomposición de la lactosa de la leche a ácido láctico es una de las causas de la naturaleza ácida de los efluentes provenientes de este tipo de industrias (Ashish and Omprakash; 2014).

También se establece que los niveles aceptables para sólidos SS deben ser de 0 ml/L a los 10 minutos y < 1 ml/L a los 120 minutos. Los resultados obtenidos se encuentran fuera de estos límites (Subsecretaría de Ecología; 2006) (Tabla 4).

Los valores de DQO obtenidos (2431 – 4441 mg O₂/L) superan ampliamente, entre 10 a 20 veces, el máximo establecido en el Decreto provincial (250 mg O₂/L). En principio, estos valores elevados podrían explicar los bajos valores de CE₅₀.

Respecto de otros parámetros, existe una correlación positiva entre la cantidad de sólidos totales y la DQO. A mayor cantidad de sólidos totales, mayor DQO (coeficiente de correlación de Pearson 0,88; p< 0,05).

Existe una relación entre la DBO5 y la DQO, en la que la primera es aproximadamente la mitad de la DQO (DBO₅/DQO = 0.5) (Centro de Investigación y DesarrolloTecnológico del Agua, INTI; 2010). A partir de los valores de DQO determinados en las muestras (2341 – 4441 mg O₂/L) se puede estimar un valor de DBO₅ entre 1215 y 2220 mg O₂/L, que supera ampliamente los límites de vertido establecidos en el Decreto Provincial 2793/06, que establece un máximo de 50 mg O₂/L para vertido en desagües a conducto pluvial abierto, curso de agua superficial y cursos de agua no permanente, y un máximo de 200 mg O₂/L para vertido en desagües a pozos o campos de drenaje (Subsecretaría de Ecología; 2006).

Durante la producción de queso es común la pérdida de leche por: derrames de los tanques de almacenamiento, pérdidas en las cubas de cuajado, rebose de los moldes y separación incorrecta del suero. Estas pérdidas son la causa del 90% del total de la DQO del efluente (INTI; 2010), el 10% restante es generado por sustancias provenientes de la limpieza (sólidos en suspensión, aceites y grasas, nitrógeno orgánico y detergentes) (Industrial; 2008).

Durante la etapa de salado del queso se utilizan salmueras de cloruro de sodio, que una vez utilizadas son desechadas junto con el resto del vertido de la industria; conduciendo a valores elevados de conductividad en los efluentes de este tipo de industrias (Industrial; 2008, INTI; 2010).

Las CE₅₀ para las muestras correspondientes a la entrada de la planta de tratamiento fueron < 1%. Estos valores tan bajos indican una toxicidad elevada del efluente. Para las muestras de salida, las CE₅₀ fueron mayores (2,56 – 2,66 %). Aunque las CE₅₀ para las muestras de salida de la planta de tratamiento fueron más elevadas que las de la entrada, la toxicidad de las muestras sigue siendo alta (Figura 8), ya que el aumento de las CE₅₀ no es representativo de una mejora sustancial en la toxicidad, indicando que la eficiencia de la plata de tratamiento sería baja.

Figura 8: Evaluación de la toxicidad del efluente a la entrada y salida de la planta de tratamiento

A: se presentan los resultados de las seis muestras tomadas en la planta de tratamiento a la entrada (E) y a la salida (S). La CE₅₀ (en %) está expresada con sus respectivos índices de confianza 95%. B: Gráfico de los valores promedio de las CE₅₀ a la entrada y la salida.

(A)

Muestra

CE₅₀

IC 95% (CE₅₀)

M1 - E

<1

M1 - S

2,56

1,126 - 5,776

M2 - E

<1

M2 - S

s/d

M3 - E

<1

M3 - S

2,66

1,458 - 5,042

(B)

5. Conclusiones

El estudio de los riesgos a la salud o económicos derivados de exposición a sustancias químicas presentes en el ambiente es un área de vacancia relativa en la provincia de La Pampa. Las herramientas con que cuenta la toxicología permiten evaluar problemáticas locales, identificando aquellas emergentes en el área del ambiente.

En este caso en particular se ha evaluado el riesgo ambiental asociado a la presencia de contaminantes en efluentes generados en un establecimiento de fabricación de quesos de la provincia de La Pampa.

En cuanto a la evaluación de toxicidad, se han realizado bioensayos de toxicidad aguda con Daphnia magna como organismo de prueba.

Respecto a los valores de CE₅₀ obtenidos, si bien resultaron ser mayores a la salida que a la entrada de la planta de tratamiento, aún son muy bajas, lo que denota toxicidad elevada y una ineficiencia del proceso de tratamiento. Si bien los bioensayos con Daphnia nos permitieron generar una herramienta para establecer bio-marcadores de contaminación en establecimientos queseros, para ampliar la evaluación del riesgo toxicológico se podría complementar con bioensayos en otros organismos de prueba, tales como algas, Hydras y/o semillas.

De acuerdo a los datos obtenidos a partir de los parámetros fisicoquímicos, se concluye que el efluente se encuentra fuera de los límites de vertido permitidos por la legislación vigente en la Provincia de La Pampa, establecidos en el Decreto Provincial Nº 2793/06.

Es necesaria una revisión del método de tratamiento del efluente, así como también de la capacidad de la planta en relación a la cantidad de residuo líquido que emite.

Sería necesario contar con mayor cantidad de información respecto al proceso productivo y los productos utilizados en las etapas de limpieza y desinfección y evaluar así su asociación con alguno de los resultados obtenidos.

Disminuir la cantidad de materia orgánica y sólidos en el residuo líquido, causantes de los elevados valores de DQO y de las bajas CE₅₀, es uno de los objetivos principales del tratamiento del efluente. La filtración y/o aireación, son dos alternativas a tener en cuenta a la hora de pensar una reestructuración del proceso de tratamiento.

Por último, para un óptimo funcionamiento de la planta de tratamiento es importante establecer un calendario de mantenimiento y limpieza de ésta, así como también determinar períodos de control de parámetros físico químicos para un mejor seguimiento de la eficiencia de la planta.

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